مقاله علمی با منبع : ارزیابی پتانسیل مارکرهای ISSR در پیش بینی کارایی هیبرید ها و بررسی …

مدیریت تنوع طبیعی موجود در ارقام اهلی و خویشاوندان وحشی یک گونه گیاهی در انجام یک برنامه موثر به منظور اصلاح گیاه زراعی بسیار مهم است. زیرا بسیاری از خویشاوندان وحشی گیاهان زراعی حاوی ژنهایی هستند که سبب مقاومت به استرس های زنده و غیر زنده،خشکی،شوری و سرما )می شوند. پس می توان این ژنها را به واریته های تجاری منتقل کرد و از کاهش شدید عملکرد جلوگیری نمود.(وجدانی ،۱۳۷۲ و کومار،۱۹۹۹).
با بهره گرفتن از برنامه های دقیق تعیین تنوع ژنتیکی و انتخاب هدفمند نمونه ها، می توان حجم نمونه های موجود در ژرم پلاسم را کاهش داد. بررسی دقیق تر روابط ساختاری و هویت ژنتیکی بانک های ژنی، اداره موثر آنها را برای محققان آسان تر خواهد کرد . از سوی دیگر تعیین سطح تنوع ژنتیکی در گونه های گیاهی، در جهت انتخاب والدین در برنامه های اصلاحی و بهره وری از پدیده هتروزیس[۱۹] اهمیت شایانی دارد(ارزانی، ۱۳۸۳). تنوع موجود در یک ژرم پلاسم می تواند منجر به انتخاب ارقام بهتر و همچنین از این تنوع درجهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد(لامکی و لی،۱۹۹۳). ارقام زراعی گلرنگ بطور فوق العاده ای در صفات فیزیولوژیک،مورفولوژیک و خصوصیات شیمیایی روغن متنوع هستند (سینگ ونیمبکار،۲۰۰۷).
تنوع ژنتیکی در مقابل تنوع جغرافیایی
درگذشته هنگام انتخاب والدین برای عمل دو رگ گیری فاصله جغرافیایی جفت های والدینی را مورد توجه قرار می دادند به این دلیل که واریته های برتر از آمیزش واریته ها و حتی گونه هایی بدست می آیندکه از نظر جغرافیایی از یکدیگر دور هستند. در اوایل قرن بیستم مفهوم فاصله جغرافیایی جای خود را به تنوع ژنتیکی داد و مشخص شد وجود صفات برتر در ارقام به دلیل فاصله جغرافیایی نبوده بلکه به دلیل تفاوت ژنتیکی بین ارقام است . بنابراین کار با تنوع ژنتیکی اهمیت بالاتری از فاصله جغرافیایی دارد.تطابق بین تغییر پذیری جغرافیایی با تنوع ژنتیکی وقتی محقق می شود که منشاء موارد را بتوان به دقت تعقیب نمود. تنوع ژنتیکی حاصل تغییرات در میان ژنوتیپ های یک گونه است (اسپگنولتی و کالست،۱۹۸۷).
اهمیت ایران از نظر منابع ژنتیکی
غنی ترین منبع ژنتیکی هر گونه خاستگاه یا منطقه جغرافیایی آن است که آن گونه از آن منشاء گرفته است . این مرکز غالباً مرکز تنوع نامیده می شود یعنی منطقه ای که حداکثر تفاوت بین ژنوتیپ های موجود را دارد . مرکز پیدایش گیاهان زراعی که توسط واویلوف مشخص شده ،شامل چین ،آسیای جنوبی ،آسیای مرکزی ، آسیای صغیر ،مدیترانه ،آمریکای مرکزی و جنوبی و حبشه است . ایران به دلیل موقعیت جغرافیایی خاص خود،از نظر مواد ژنتیکی بسیاری از گیاهان ،یکی از غنی ترین نقاط دنیا محسوب می شود و جزء پنج کشور اول دنیا از لحاظ تنوع زیستی در گونه های گیاهی است . برای مثال ایران مرکز پیدایش گیاهانی همانند جو، گندم و گلرنگ است (وجدانی، ۱۳۷۲ و قره یاضی، ۱۳۸۵).
بررسی تنوع ژنتیکی
از آنجایی که فرضیات مختلف توجیه کننده هتروزیس نظیر غالیبت و فوق غالبیت وجود یک رابطه مثبت بین تعداد مکان ژنی هتروزیگوس یک صفت و عملکرد و کارایی هیبرید را تایید می کند بنابراین یک راه تخمین مقادیر ترکیب پذیری خصوصی و هتروزیس،تخمین عملکرد هیبرید ها قبل از انجام تلاقی ها و ارزیابی های مزرعه ای از طریق تعیین فاصله ژنتیکی والدین با بهره گرفتن از صفات مورفولوژیک یا دادهای مارکر می باشد (لامکی، ۱۹۹۳). همچنین طراحی و اجرا ی یک برنامه اصلاح نباتات برای اصلاح یک صفت کمی تا حد زیادی به میزان تنوع ژنتیکی ژرم پلاسم بستگی دارد.مطالعه پلی مورفیسم در میان ژرم پلاسم فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می آورد.انتظار می رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتری نتاج برتری تولید کرده و میانگین صفت را در جمعیت بالا ببرند. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین فاصله ژنتیکی نسبی موجود بین یا جمعیت ها در برنامه های اصلاحی اهمیت ویژه ای دارد زیرا سازمان دهی ژرم پلاسم و گزینش بطور موثری انجام می شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ هاتکمیل کننده اطلاعات فنوتیپی در پیشبرد اصلاح جمعیت ها است.همچنین اطلاع از شباهت های ژنتیکی در میان ژنوتیپ ها موجب می شود انتخاب والدین در یک تلاقیبطور موثر تری انجام پذیرد و هتروژیس خوبی بروز پیدا کند بنابراین شناسایی سریع و قابل اطمینان ژنوتیپها برای انجام برنامه های اصلاحی و همچنین پروژه های تولید بذر در محصولات زراعی ضروری است (نولی،۱۹۹۹).
روش های آماری بررسی تنوع ژنتیکی
به منظور مطالعه تنوع ،عموماً از ضرایب تغییرات ژنتیکی (GCV)[20] و ضریب تغییرات فنوتیپی (PVC)[21]استفاده می شود.مطالعه تنوع ژنتیکی فرایندی است که تفاوت بین افراد،جمعیتها و یا گرو هها با بهره گرفتن از روش های آماری خاص بر اساس داده های حاصل از ارزیابی صفات مختلف بررسی می شود. تنوع ژنتیکی می تواند بر اساس صفات مورفولوژیک (کیفی و کمی )، شجره افراد و یا خصوصیات مولکولی افراد بیان شود.هر چند صفات مورفولوژیکی و شجره ای به عنوان معیارهایی در مطالعه تنوع ژنتیکی در جمعیت های گیاهی و جانوری مورد استفاده قرار گرفته اند ولی در سالهای اخیر با پیشرفت در زمینه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی ، مارکر های مولکولی به عنوان ابزاری کارا در بررسی تنوع ژنتیکی مطرح شده اند (یو ،۱۹۹۳).
عموماً روش های متداول برای شناسایی و بررسی های ژنتیکی مبتنی بر مشاهدات فنوتیپی بوده و از این جهت فاقد الگو های تنوع ژنتیکی در سطح ژنوم می باشند. علاوه بر این به دلیل ماهیت پلی ژنی بسیاری از این صفات و اثر عوامل محیطی نیاز به جمع آوری داده های فراوان در مکانهای مختلف بوده و در بعضی موارد میزان پلی مورفیسم برای برخی صفات مورفولوژیک بسیار محدود می باشد.از این لحاظ سایر روشها علاوه بر روش های مبتنی بر صفات مورفولوژیک مورد استفاده قرار می گیرند (نولی ،۱۹۹۹). روش های مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی ابداع شده است که در ذیل به برخی از آنها اشاره می شود :
تجزیه کلاستر
تجزیه کلاستر یکی از متداول ترین روش های چند متغیره در بررسی تنوع ژنتیکی و گروه بندی افراد می باشد .این روش در مواردی استفاده می شود که الگوی گروه بندی قبلی برای افراد وجود نداشته باشد. الگوریتم های مختلفی برای تجزیه کلاستر پیشنهاد شده است.این الگوریتمها به دو گروه اصلی تقسیم می شوند (۱) روش های مبتنی بر فاصله یا شباهت بین افراد یا ژنوتیپ ها برای گروه بندی استفاده می شود.(۲) روش های مبتنی بر مدل که در آنها فرض بر این است که افراد درون هر کلاستر مشاهدات تصادفی از برخی مدلهای پارامتری بوده و استنباط های آماری مربوط به پارامتر های هر کلاستر با بهره گرفتن از روش های آماری استاندارد مانند حداکثر درست نمایی انجام می گیرد.در مطالعات ژنتیکی بیشتر روش های مبتنی بر فاصله بخصوص الگوریتم های طبقاتی استفاده می شوند (فرشاد فر،۱۳۷۷).
تجزیه به مولفه های اصلی
در کنار تجزیه کلاستر PCA[22] از متداول ترین روش های آماری چند متغیره در مطالعات ژنتیکی برای گروه بندی و بررسی تنوع می باشد. هدف از این تجزیه یافتن ترکیباتی ازP متغیر جهت ایجاد شاخص های غیر مستقل بنام مولفه های اصلی است.در تجزیه به مولفه های اصلی با بهره گرفتن از داده های مارکر های مولکولی بایستی توجه داشت که نمایش گرافیکی و گروه بندی بر اساس دو یا سه PCA نمی تواند نشان دهنده تغییرات کل متغیر های اولیه باشد . در نتیجه توصیه می شود که گروه بندی بر اساس تعداد زیاد PCA که تغییرات بیشتری را توجیه می کنند انجام گیرد (فرشاد فر، ۱۳۷۷).
معیار های فاصله یا شباهت ژنتیکی
فاصله یا شباهت ژنتیکی بین ژنوتیپها یا جمعیت ها می تواند بسته به نوع صفات مورد مطالعه و داده های حاصله با بهره گرفتن از روش های مختلف برآورد شود. در مورد داده های حاصل از صفات کمی فاصله اقلیدسی یکی از متداول ترین معیار های برآورد فاصله ژنتیکی است. برای صفات کیفی یا داده های مارکر که بصورت صفر و یک بیان می گردند،ضرایب متعددی برای برآورد فاصله یا شباهت به کار برده می شوند. از این معیار ها می توان به ضریب شباهت ژاکارد[۲۳] ،ضریب نی و لی[۲۴] ،ضریب تطابق ساده[۲۵] و ضریب تغییر یافته روگر اشاره کرد. برای ژنوتیپهای هموزیگوس یا مواد ژنتیکی خالص ضریب ژاکارد و نی نتایج مشابهی برای مارکر های غالب و هم بارز خواهند داشت.ولی در صورتیکه مواد ژنتیکی هتروزیگوس باشند با توجه به اینکه با مارکر های غالب امکان تمایز افراد هموزیگوس از هم وجود ندارد،بنابراین ضرایب نی و ژاکارد برآورد متفاوتی از شباهت ژنتیکی خواهند داشت(رحیمی نژاد، ۱۳۸۵).
روش های برآورد تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگرها
توسعه ژنتیکی گونه ها و ژنوتیپ ها از طریق روش های اصلاحی به توانایی تشخیص و تفکیک اثرات ژنتیکی از اثرات محیطی بستگی دارد. انتخاب به کمک نشانگر ها شرایط مناسبی را برای انتخاب سریع و کاهش جمعیت اولیه ایجاد می کند (استاب و همکاران،۱۹۹۶). نشانگر ها را می توان به سه گروه مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی تقسیم بندی نمود.اگر بیان خصوصیات مورفولوژیکی در طیفی از شرایط محیطی قابل تکرار باشد، می توانند بعنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند. ولی از آنجا که نشانگرهای مورفولوژیکی تحت تاثیر محیط قرار می گیرند این امر می تواند بیان ژنها را تحت تاثیر قرار دهد. این نشانگرها غالباً متاثر از سن و مرحله رشدی گیاه هستند و تعدادشان نیز کم می باشد که این امر کارایی نشانگر های مورفولوژیکی را بعنوان نشانگر ژنتیکی کاهش می دهد.علاوه بر این گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهورشان شد که در گیاهان چند ساله مشکل است (استاب و همکاران،۱۹۹۶).
بررسی تنوع ژنتیکی یک گونه گیاهی از طریق صفات مورفولوژیکی قابل محاسبه است.تنوع ژنتیکی تعدادی از ژرم پلاسم های گلرنگ از طریق صفات مورفولوژیک توسط آشری (۱۹۷۵)، سنگام و همکاران (۲۰۰۵)،جارادات و شهید(۲۰۰۶)، خان و همکاران (۲۰۰۵) و امینی و همکاران (۲۰۰۷) مورد بررسیقرار گرفته است . تحقیقات متعددی در زمینه رابطه بین اجزای عملکرد دانه انجام گرفته است.پاسگال و آلبورکرک (۱۹۹۶)در مطالعه ۲۳ ژنوتیپ گلرنگ نتایج زیر را منتشر کردند.الف) همبستگی مثبتی بین تعداد شاخه در بوته با ارتفاع کل گیاه و با تعداد دانه در غوزه پیدا شد. ب )همبستگی منفی بین وزن هزار دانه با تعداددانه در غوزه و زود رسی مشاهده شد.ج) عملکرد دانه با تعداد غوزه در بوته، تعداد شاخه در بوته و با ارتفاع گیاه همبستگی مثبت داشت.
برادران و زینال (۱۳۷۵)گزارش نمودند که عملکرد دانه بالاترین همبستگی را با تعداد دانه در غوزه دارد، در حالیکه صفات وزن صد دانه، ارتفاع گیاه،تعداد دانه در غوزه و میزان روغن همبستگی بالایی با عملکرد دانه ندارند. چاوهاری (۱۹۹۰) در مطالعه صفات مرتبط با عملکرد دانه نتیجه گیری نمود که با گزینش برای تعداد غوزه در بوته وتعداد دانه در بوته می توان به بیشترین پیشرفت اصلاحی نایل آمد. باقری و همکاران (۱۳۸۰) در یک پژوهش بر روی ۱۲۱ ژنوتیپ گلرنگ گزارش نمودند که عملکرد دانه با صفات تعداد غوزه در گیاه، ظهور اولین گل و تعداد دانه در غوزه همبستگی مثبت دارند.آنها همچنین گزارش نمودند که تعداد غوزه در گیاه بیشترین تاثیر را روی عملکرد دانه تک بوته دارد.
روجاس و همکاران (۱۹۹۳) در مطالعه بر روی ۱۸۸ ژنوتیپ حاصل از یک کلکسیون جهانی گلرنگ گزارش کردند که وزن صد دانه بین ۶/۶-۹/۱ گرم متغیر بود و میانگین آن ۲/۴ گرم بدست آمد. همچنین این ژنوتیپ ها تنوع زیادی در میزان پوسته دانه (۶۰-۲۲ درصد )را نشان دادند که جهت استفاده در برنامه های اصلاحی آینده مفید خواهد بود.دهارو در مطالعه یک کلکسیون جهانی گلرنگ بر روی ۱۹۹ رقم گزارش کردند که وزن صد دانه بین ۵۸/۶-۹۲/۱ با میانگین آن ۲۱/۴ گرم می باشد. ژنوتیپ های ایرانی و عراقی برای این صفت حداقل مقدار را نشان دادند در حالیکه ژنوتیپ های هندی حداکثر وزن صد دانه را داشتند. آلبا و همکاران (۱۹۸۷) تنوع موجود در بین جوامع گلرنگ با منشاء های مختلف جغرافیایی را بررسی کردند. در این مطالعه آنها تعداد ۶۰ ژنوتیپ از هشت منشاء جغرافیایی مختلف را بصورت تصادفی انتخاب و در قالب طرح بلوک کشت نمودند و ۱۴ صفت را اندازه گیری کردند. بیشترین تنوع فنوتیپی مربوط به صفاتی همچون تعداد شاخه های اولیه، ثانویه،و ثالثیه، تعداد غوزه های روی شاخه های فرعی و عملکرد دانه بود. صفاتی مانند ارتفاع گیاه، وزن صد دانه، درصد جوانه زنی بذرها، طول دانه و کیفیت دانه (روغن و پروتئین ) درصد پایینی از تنوع را نشان دادند.
جارادات و شهیدی (۲۰۰۶) هفت صفت مورفولوژیکی را در ارقام گلرنگ اندازه گیری کردند. آنها کمترین و بیشترین تنوع را به ترتیب برای طول دوره روزت و خار یا بدون خار بودن ارقام به مقدار ۱۴ درصد و ۵۰ درصد گزارش نمودند .
گریوانی و همکاران (۱۳۸۸) در یک تحقیق بر روی ۲۵ ژنوتیپ گلرنگ گزارش کردند که توارث پذیری عمومی صفات تعداد روز تا گلدهی،وزن صد دانه و ارتفاع گیاه بالاست و توارث پذیری عملکرد دانه نیز نسبتاً بالا می باشد در حالیکه بیوماس و تعداد روز تا رسیدگی وراثت پذیری عمومی کمی داشتند. امینی و همکاران (۲۰۰۷) با بررسی ۳۲ ژنوتیپ گلرنگوراثت پذیری عمومی وزن صد دانه و تعداد روز تا ۵۰ درصد گلدهی را بیشتر از سایر صفات گزارش کردند. آنها همچنین وراثت پذیری عمومی تعداد روز تا سبز شدن و تعداد طبق در گیاه را به ترتیب ۳۳/۶۹ و ۵۰/۶۹ درصد گزارش نمودند.
قدرتی (۱۳۷۶) نیز وراثت پذیری وزن صد دانه و طول شاخه های فرعی ژنوتیپ های گلرنگ را به ترتیب ۹۰ و ۷ درصد گزارش کرد. وی اعلام نمود که صفات مورفولوژیک قادر به شناسایی ژنوتیپ ها از یکدیگر نیستند ولی قادر به دسته بندی ارقام بر اساس منطقه جغرافیایی می باشند.الفدل و همکاران (۲۰۰۹) در بررسی ۲۰۰ ژنوتیپ گلرنگ از ۱۱ منطقه متفاوت دنیا نشان دادند که ضریب تغییرات برای ۱۲ صفت فنوتیپی اندازه گیری شده بین ۹/۲ تا ۹۱ درصد بود. صفات عملکرد دانه در یک متر مربع ، عملکرد تک بوته و تعداد دانه در بوته بیشترین تغییرات را داشتند. قابلیت توارث صفات بین ۱۰ درصد (ورس) و ۸۶ درصد (ارتفاع گیاه ) اندازه گیری شد. تعداد دانه در بوته و وزن هزار دانه همبستگی بالایی با عملکرد دانه داشتند و گزینش برای این صفات برای اصلاح عملکرد دانه و میزان روغن مفید است. نتیجه تجزیه به مولفه های اصلی نشان داد که ۷۸ درصد از تنوع فنوتیپی در ژرم پلاسم گلرنگ بر اساس چهار مولفه اصلی توضیح داده می شود. تجزیه کلاستر نشان داد که توزیع ژنوتیپ ها در داخل دسته ها با الگوی جغرافیایی مطابقت ندارد.
مهمترین عامل در استفاده از روغن های گیاهی ترکیب اسید های چرب آن است که هر چه میزان اسید چرب اشباع نشده بیشتر باشد کیفیت بالاتری دارد و برای سلامتی مفیدتر است (فرناندزمارتینر،۲۰۰۲). روغن گلرنگ عمدتاً شامل دو اسید چرب اشباع نشده اوائیک و لینولئیک است که بالغ بر ۹۰ در صد اسید چرب دانه را شامل می شود و بقیه آن مربوط به اسید چرب اشباع پالمتیک و استئاریک است (نولز،۱۹۸۹). داگلاس و همکاران (۲۰۰۴) اظهار داشتند که ۳۳ درصد از تغییرات درصد روغن ناشی از اثرات عوامل محیطی، تاریخ کاشت و مدیریت در طول دوره رشد گیاه است و ۶۷ درصد دیگر تغییرات، وابسته به فاکتورهای ژنتیکی است.فرناندز و همکاران (۱۹۹۳) با بررسی ترکیب اسید های چرب ۲۰۰ رقم گلرنگ گزارش کردند که دامنه تنوع اسیداولئیک ۶/۹۰-۷/۳ درصد و اسید لینولئیک ۸/۸۸-۹/۳ درصد است.
دهارو(۱۹۹۱) در یک بررسی گزارش نمود که مقدار روغن ارقام مورد بررسی گلرنگ بین ۸/۶۵-۲/۱۹ درصد متغیر بود که تعدادی از ارقام عراقی،هندی و پاکستانی حداکثر مقدار این صفت را از خودشان نشان دادند.میانگین اسید پالمتیک ۱/۷ (دامنه ۹-۶/۴) درصد و اسید استئاریک دارای میانگین ۲/۳ (دامنه ۶/۷-۳/۱) درصد بود. بالاترین مقدار اسید استئاریک در ژنوتیپ های افقانستان مشاهده شد. اسیداولئیک و اسید لینولئیک دامنه تنوع زیادی به ترتیب ۲/۸۴-۵/۹ درصد و ۸۰-۱/۹ درصد را نشان دادند. این تنوع و نحوه توزیع آنها در ژنوتیپ ها اشاره به ژنهای مشمول افزایش مقدار اسید اولئیک و یا سایر ژنهای کنترل کننده آن در کلکسیون مورد مطالعه دارد. بیشترین مقدار اسید اولئیک در ژنوتیپ های کنیا و اردن مشاهده شد و برای اسید لینولئیک در یک ژنوتیپ از کشور پرتقال اندازه گیری شد.خان وهمکاران (۲۰۰۳) با مطالعه ۱۹۳ ژنوتیپ از هشت منطقه دنیا (جنوب غربی آسیا، شرق اروپا، مرکز شرق اروپا، آفریقا ، مدیترانه، شرق آسیا و آمریکای شمالی ) تنوع زیادی در صفات مورفولوژیکی (تعداد روز تا گلدهی و ارتفاع گیاه، رنگ گل، اندازه غوزه ) و اسید های چرب مشاهده نمودند.تغییرات اسید اولئیک ۴/۲۹-۸/۷ درصد و اسید لینولئیک ۶/۸۳-۲/۶۲ درصد و اسید پالمتیک ۸/۱۲-۸/۱ درصد بود. مقدار اسید لینولئیک و تعداد روزها تا رسیدگی بین مناطق مختلف تفاوت زیادی معنی داری را نشان داد. نتایج تمام محققان نشان داد که تغییرات ژنتیکی بین ارقام گلرنگ وجود دارد که می تواند در برنامه های اصلاحی و انتخاب مستقیم برای کلکسیون های ژرم پلاسم این گیاه مورد استفاده قرار گیرد.
برخی از تفاوت های موجود در ردیف های DNAبین دو موجود، ممکن است به صورت پروتئین هایی با اندازه های مختلف ظاهر گردد،که از طریق شیمیایی قابل ثبت و مطالعه می باشند. در دهه ۱۹۵۰ آیزوزایم ها، بطور گسترده ای در بررسی تنوع ژنتیکی و طبقه بندی گیاهان بکار گرفته شدند. از معایب این نشانگرها ، محدود بودن روش های رنگ آمیزی پروتئین،و تعداد و پایین بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آنها است. همچنین آیزوزایم ها ،در گیاه در زمان خاصی بیان می گردند،بنابراین استخراج پروتئین باید در زمان خاصی و از بافت ویژه ای صورت گیرد که این امر خود نوعی محدودیت زمانی برای استفاده از سیستمهای آیزوزایمی است (عبدمیشانی و بوشهری، ۱۳۷۶ و نقوی و همکاران،۱۳۸۶).در مورد نشانگرهای DNAاصول و کاربرد آنها تفاوت قابل ملاحظه ای با نشانگرهای مورفولوژیک و پروتئینی ندارد، اما تحولی که در زمینه کشاورزی به خصوص در اصلاح نباتات ایجاد کرده است به دلایل زیر باشد.
۱-فراوانی فوق العاده این دسته از نشانگرها ۲- عدم تاثیر گذاری آنها از شرایط محیطی ۳- امکان به کارگیری آنها در مراحی اولیه رشد گیاه ۴- فراهم نمودن امکان مطالعه گیاهان در خارج از فصل و محل کشت ۵- دقت و قابلیت بالای تفسیر نتایج ۶- همبارز بودن اکثریت آنها ۷- سهولت تعقیب نشانگرها در نتاج و تعیین الگوی توارثی آنها ۸- امکان استفاده از آنها در مورد گونه های منقرض شده ۹- سهولت تشخیص گیاهان ناخالص از خالص ۱۰- سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج ۱۱- دسترسی به نرم افزارهای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج. نشانگرهایDNA را می توان به دو دسته نشانگرهای مبتنی بر PCRو نشانگرهای مبتنی بر هیبریداسیون تقسیم بندی نمود. زمینه های کاربرد این نشانگرها شامل انگشت نگاری DNA به منظور شناسایی ارقام و واریته های گیاهی، مطالعات فیلوژنتیکی و تنوع ژنتیکی، تهیه نقشه های ژنومی به منظور انتخاب به کمک نشانگر ها می باشد (نقوی و همکاران ۱۳۸۶ و قره یاضی،۱۳۸۰).
کاربرد نشانگرهای مولکولی و یا بعبارت دیگرDNA، بسیاری از مشکلات مرتبط با نشانگرهای مورفولوژیکی و آیزوزایمی را برطرف می کند. این دسته از نشانگرها از طریق تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل رویت هستند (گودوین ،۱۹۹۷). اولین نشانگرDNA،که در گیاهان استفاده شد نشانگر RFLP بود(بوتستین و همکاران ،۱۹۸۰). این تحول از پیامد های کشف آنزیم های برش دهنده بود. نشانگرهای DNA در مدت یک دهه تکامل شگرف و تحسین برانگیزی داشته اند. انواع مختلف نشانگرهای DNAبا تفاوت های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه امتیاز بندی و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیدند. بدون شک ابداع و معرفی واکنش زنجیره ای پلیمراز([۲۶]PCR ) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. سپس نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز همانندRAPD(ویلیامز،۱۹۸۶)؛ SSR (لیت و لوتی،۱۹۸۹)؛AFLP (وس،۱۹۹۵)؛ ISSR (زیتکی ویز و همکاران،۱۹۹۴) و غیره معرفی شدند.
نشانگر مولکولی ISSR[27]
مطالعات قبلی نشان می دهدکه تنوع ژنتیکی پایینی برای ژنوتیپ ها و جنس های گلرنگ با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD(ویلاترسانا و همکاران، ۲۰۰۵ و معالی امیری و همکاران ،۲۰۰۱) SNP(چاپمن و همکاران ۲۰۰۷) و VNP (بولس و همکاران ،۲۰۱۰) اندازه گیری شده است. بنابراین استفاده از یک نشانگر جدید برای بررسی تنوع ژنوتیپها وجنس های گلرنگ ضروری است .ISSR یک سیستم نشانگرمناسب برای کاندید شدن است (الگرن،۲۰۰۴).
روش ISSR-PCR برای اولین بار توسط زیتکی ویز و همکاران در سال ۱۹۹۴ معرفی شد. این روش به سرعت در زمینه های مختلف مطالعه گیاهان مورد استفاده قرار گرفت. تکنیک (ISSR) یک روش وابسته به PCR است که شامل تکثیر بخشی از DNA می باشد که در یک فاصله قابل تکثیربین دو ناحیه تکرار ریزماهواره های مشابه قرار دارد که در جهت مخالف هم آرایش یافته اند.در این متد،SSR ها به عنوان آغازگر برای تکثیر نواحی بینSSR ها مورد استفاده قرار می گیرند. (تاوتزو رنز،۱۹۸۴). در این روش میکروساتلایت هایی با طول ۲۵-۱۶ نوکلئوتیدی بعنوان آغازگر استفاده می شوند.میکروساتلایت که بعنوان آغازگر استفاده می شوند می توانند دو، سه،چهار و پنج نوکلئوتیدی باشند.ISSR در مقایسه با آغازگر RAPD (۱۰نوکلئوتید) به دلیل استفاده از آغازگرهای بلند تر (۲۵-۱۶) از تکرار پذیری بالاتری برخوردار هستند. آغازگرهای بلند اجازه می دهند تا بتوان از دمای اتصال (۶۰-۴۵) بالاتری استفاده کرد. آغازگرهائی که در ISSRمورد استفاده قرار می گیرند می توانند در انتهای ′۳یا′ ۵ قلاب شوند.آغازگر غیر قلاب شده می تواند به هر جایی در ناحیه میکروستلایت روی DNAالگو متصل گرددو چون قلاب شده نیست ممکن است روی DNA الگو سر بخورد، در نتیجه باند های متعدد تولید نماید.آغازگر های قلاب شده در انتهای ′۳یا ′۵ فقط در ناحیه اختصاصی به DNA الگو متصل می شوند و باند های واضحی را تولید می نماید (گوپتا و همکاران ۱۹۹۴؛ میر و همکاران ،۱۹۹۳ و یو و همکاران ،۱۹۹۴).
مطالعاتی که بر روی تکرار پذیری آن انجام شده، نشان داده است که فقط ضعیف ترین باند ها هستند که قابل تولید مجدد نیستند حدود ۹۵-۹۲ درصد از بخش های نمره دهی شده وقتی که با بهره گرفتن از پلی آکریلامید شناسایی شدند می توانند در نمونه های DNA مشابه و در PCR های مجزا تکرار شوند (فانگ و رنر، ۱۹۹۷ و مورنو و همکاران ،۱۹۹۸).
نشانگرهای ISSR اکثراً به عنوان نشانگرهای غالب جدا می شوند که توارث مندلی ساده را دنبال می کنند (تسومارا،۱۹۹۶). این روش یک روش سریع، کارآمد، ساده، کم هزینه، قابلیت خود کار شدن و قابل تکرار است که اکثر فواید و مزایای ISSR و AFLP را برای عمومیت RAPD در بر دارد.این روش نیازی به استفاده از مواد رادیواکتیو خطرناک ندارد. آغازگرها نیز اختصاصی نبوده و می تواند براحتی طراحی و ساخته شوند (وانگ و همکاران ۱۹۹۸، یو و همکاران، ۱۹۹۴ و گوبتا و همکاران ۱۹۹۴). محصولات تکثیر شده نشانگرهای ISSR معمولاً بین ۲۰۰۰-۲۰۰ جفت باز طول دارند و توسط الکتروقورز با ژل پلی آکریلامید و آگارز قابل شناسایی می باشند.
از زمینه های کاربرد ISSRمی توان به انگشت نگاری ژنوم،نقشه یابی ژنوم، نشانمند کردن ژن و گزینش به کمک نشانگر، مطالعه تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی اشاره نمود. در تخمین تنوع ژنتیکی در سطح درون گونه ای و میان گونه ای در تعداد زیادی از گونه های گیاهی مانند برنج، گندم، ارزن انگشتی، سیب زمینی و غیره از نشانگر ISSR استفاده شده است.فانگ و همکاران (۱۹۹۷) نشان دادند که آغازگرهای قلاب شده ISSR بسیار مفید و تکرارپذیرتر از آیزوزایم ها، RFLP و RAPD در تجزیه تنوع ژرم پلاسم نارنگی سه برگی هستند. از نشانگر های ISSR به عنوان وسیله ای در شناسایی ژنوتیپ ها و همچنین ساختار جمعیتی گونه های گیاهی ذرت (کانتی و همکاران ،۱۹۹۸) سیب زمینی (پروست و ویلکینسون،۱۹۹۹)، پرتقال سه برگی (فانگ و همکاران ،۱۹۹۷) و گندم نان (ناگااوکا و اوگی هارا،۱۹۹۷)استفاده شده است.
بلایر و همکاران (۱۹۹۹) در بررسی ۵۹ رقم برنج توسط مارکر ISSR و AFLP گزارش کردند که درصد پلی مورفیسم مشاهده شده توسط روش ISSRنسبت به AFLP بیشتر است. آغازگرهای دو نوکلئوتیدی نسبت به آغاز گرهای سه، چهار،پنج نوکلئوتیدی و سایر آغازگرهای تخصصی چند شکلی بیشتری نشان دادند.
فارسانی و همکاران (۱۳۸۶) تنوع ژنتیکی ۲۷ ژنوتیپ گیاه پنجه مرغی را توسط تعدادی صفات مورفولوژیک و نشانگر مولکولی ISSR مطالعه کردند.طبق گزارش آنها ژنوتیپ ها بر اساس ارتفاع گیاه به سه دسته مجزا تقسیم شدند. توسط چهار آغازگر ISSR در تشابه ۳۴ درصد در چهار گروه قرار گرفتند.
نان وهمکاران (۲۰۰۳) با مطالعه ۶۰ گیاه پامچال شامل چهار جمعیت طبیعی و یک جمعیت زراعی توسط نه آغازگر ISSR گزارش نمودند که تنوع موجود در بین گیاهان اهلی شده کمتر از جمعیت های طبیعی است. دلیل کاهش چشم گیر تنوع در جمعیت مزبور به خاطر فعالیت انسان در منطقه جمعیت اهلی شده می باشد.

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  pipaf.ir  مراجعه نمایید.