بررسی فیتوشیمیایی و ارزیابی خواص ضد میکروبی عصاره های متانولی چند نوع گونه گیاهی علیه باکتری های گرم مثبت و منفی- قسمت ۱۵

 

 

 

 

 

 

ساپونین

 

 

۳-۲-۵ ارزیابی میزان فنل
در این پژوهش، مقدار کل ترکیبات فنولی عصاره­های استخراج شده از گیاهان بادام کوهی (Amygdalus scoparia)، بومادران (Achillea millefolium)، کلپوره (Teucrium polium)، گلپر (Heracleum persicum) و مریم گلی (Salvia officinalis) به­روش فولین سیوکالتیو ۱ اندازه ­گیری شد. معادله خط رگرسیونی که رابطه غلظت­های مختلف محلول آنتی­اکسیدان سنتزی (اسید گالیک) را با میزان جذب نمونه­­ها در طول موج ۷۶۰ نانومتر نشان می­دهد، به صورت ذیل می­باشد.
Y=0.0746X+0.0819 R2=0.979
در این رابطه، Yو X به ترتیب معادل جذب عصاره­های متانولی گیاهان مورد مطالعه در طول موج ۷۶۰ نانومتر و میزان ترکیبات فنلی عصاره­ها بر اساس میزان معادل میلی­گرم اسید گالیک در گرم عصاره خشک (mg QE/g dry sample) می­باشد.
نتایج آنالیز واریانس، در نمودارهای (شکل ۳-۱۱)، (شکل ۳-۱۲)، (شکل ۳-۱۳)، (شکل ۳-۱۴)، (شکل ۳-۱۵) و (شکل ۳-۱۶) در غلظت­های مختلف عصاره­های متانولی استخراج شده در محدوده ۵۰۰ تا ۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر به شرح ذیل می­باشد.
۳-۲-۵-۱ نتایج میزان فنل عصاره بادام کوهی
آنالیز مقایسه­ ای محتوای فنل عصاره متانولی بادام کوهی و آنتی­اکسیدانی سنتزی نشان از افزایش میزان فنل با تاثیر افزایش غلظت­های مختلف، دارد (شکل ۳-۱۱). مقایسه میانگین داده ­های فنل عصاره گیاه مورد مطالعه با آنتی­اکسیدان سنتزی (اسید گالیک) نشان داد که اختلاف زیادی در میزان فنل عصاره و اسید گالیک در غلظت­های مختلف وجود ندارد. این اختلاف در غلظت­های پائین بیشتر و در غلظت­های بالا بسیار کاهش می­یابد. نتایج آنالیز نشان می­دهد که افزایش معنی­داری در میزان فنل عصاره متانولی بادام کوهی با افزایش غلظت در سطح P<0.05 وجود دارد.
شکل (۳-۱۱) : مقایسه غلظت­های مختلف عصاره متانولی بادام کوهی (Amygdalus scoparia) با اسید گالیک بر محتوای ترکیبات فنلی. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.

۳-۲-۵-۲ نتایج میزان فنل عصاره بومادران
مقایسه میانگین میزان فنل در گونه گیاهی بومادران و آنتی­اکسیدان سنتزی در غلظت­های مختلف ارزیابی و مشخص شد که با افزایش غلظت در محدوده ۵۰۰-۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر میزان ترکیبات فنلی در عصاره به طور چشمگیری افزایش می­یابد. مقدار میانگین ترکیبات فنلی بالاترین غلظت در گروه شاهد بیشترین مقدار و برابر با ۰۸۵/۰±۰۰۳/۷ و در عصاره متانولی بومادران ۰۷۳/۰±۸۴۱/۵ میلی­گرم اسید گالیک در گرم عصاره خشک می­باشد و اسید گالیک در غلظت­های مورد بررسی میزان فنل بیشتری نسبت به عصاره بومادران دارد. مقادیر حاصل از آنالیز واریانس، طبق نمودار (شکل ۳-۱۲) در سطح P<0.05 کاملا معنی­دار می­باشد.
شکل (۳-۱۲) : مقایسه غلظت­های مختلف عصاره متانولی بومادران (Achillea millefolium) با اسید گالیک بر محتوای ترکیبات فنلی. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۵-۳ نتایج میزان فنل عصاره کلپوره
نتایج داده ­های حاصل از ارزیابی محتوای فنلی غلظت­های مختلف عصاره متانولی کلپوره با اسید گالیک نشان می­دهد که با افزایش غلظت، تفاوت کاملا چشمگیری در میانگین ترکیبات فنلی عصاره و اسید گالیک وجود دارد به نحوی که آنتی­اکسیدان سنتزی بالاترین میزان فنل را در محدوده غلظت ۵۰۰-۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر به خود اختصاص داده است. با توجه به نتایج به دست آمده، طبق نمودار (شکل ۳-۱۳) طی آزمون واریانس دریافتیم که مقادیر میزان فنل در عصاره الکلی کلپوره با اسید گالیک در سطح ۵% (P<0.05) معنی­دار است.
شکل (۳-۱۳) : مقایسه غلظت­های مختلف عصاره متانولی کلپوره (Teucrium polium) با اسید گالیک بر محتوای ترکیبات فنلی. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۵-۴ نتایج میزان فنل عصاره گلپر
نتایج آنالیز واریانس نشان داد، غلظت عصاره متانولی گلپر و اسید گالیک تاثیر معنی­داری بر محتوای ترکیبات فنولی دارد. هم­چنین، میانگین میزان فنل در عصاره گلپر و آنتی­اکسیدان سنتزی افزایش می­یابد. میزان فنل عصاره الکلی در غلظت ۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر بسیار اندک و برابر با ۰۳۰/۰±۰۶۷/۰ میلی­گرم اسید گالیک بر گرم عصاره خشک می­باشد. در حالی که آنتی­اکسیدان سنتزی در این غلظت، میزان فنل برابر با ۰۸۵/۰±۰۰۳/۷ میلی­گرم اسید گالیک بر گرم عصاره خشک را داراست. به طور کلی، افزایش میزان میانگین ترکیبات فنلی عصاره متانولی گلپر و اسید گالیک تغییرات معنی­داری (P<0.05) دارد.
شکل (۳-۱۴) : مقایسه غلظت­های مختلف عصاره متانولی گلپر (Heracleum persicum) با اسید گالیک بر محتوای ترکیبات فنلی. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۵-۵ نتایج میزان فنل عصاره مریم گلی
نتایج مقایسه محتوای فنل عصاره متانولی مریم گلی با آنتی­اکسیدان سنتزی (اسید گالیک) در غلظت­های مختلف نشان داد که میزان فنل آنتی­اکسیدان سنتزی نسبت به عصاره مورد مطالعه اختلاف مشخص و بالاتری دارد. میزان فنل عصاره مریم گلی در غلظت­های ۸/۷ و ۶۲/۱۵ پائین­ترین مقدار و به ترتیب برابر با ۰۱۱/۰± ۰۴۵/۰ و ۰۳۱/۰±۲۶۹/۰ می­باشد. همان طور که در نمودار (شکل ۳-۱۵) نشان می­دهد میانگین محتوای فنل در غلظت­های مشخص عصاره متانولی مریم گلی با اسید گالیک تفاوت معنی­داری در سطح ۵% داشته است.
شکل (۳-۱۵) : مقایسه غلظت­های مختلف عصاره متانولی مریم گلی (Salvia officinalis) با اسید گالیک بر محتوای ترکیبات فنلی. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۵-۶ نتایج مقایسه­ ای میزان فنل عصاره­ها و اسید گالیک
آنالیز مقایسه­ ای محتوای ترکیبات فنلی عصاره­های متانولی گیاهان مورد بررسی و اسید گالیک نشان می­دهد که بیشترین میزان ترکیبات فنلی در آنتی­اکسیدان سنتزی مورد مطالعه وجود دارد. پس از آن عصاره متانولی بادام کوهی و بومادران، بیشترین میزان ترکیبات فنلی را به خود اختصاص داده­اند. همان طور که در نمودار (شکل ۳-۱۶) مشاهده می­ شود، در غلظت­های پایین میزان فنل بین عصاره­های متانولی کلپوره و گلپر اختلاف معنی­داری وجود ندارد در حالی که با افزایش غلظت، میزان فنل در عصاره گلپر افزایش معنی­دار چشمگیری دارد. پائین­ترین مقدار ترکیبات فنلی در بین عصاره­های مورد بررسی مربوط به عصاره کلپوره و مریم گلی می­باشد. به طور کلی تغییرات داده ­های مورد مطالعه در سطح p<0.05 دارای اختلاف معنی­داری می­باشند.
شکل (۳-۱۶) : مقایسه میزان میانگین ترکیبات فنولی عصاره­های متانولی مورد بررسی و اسید گالیک در غلظت­های مختلف. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۶ ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی
روش­های مختلفی جهت ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی وجود دارد. در این پژوهش، از دو آزمون مهار رادیکال­های آزاد DPPH و تعیین قدرت احیاکنندگی جهت ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های مختلف گیاهی در مقایسه با آنتی­اکسیدان سنتزی اسیدآسکوبیک استفاده شد.
۳-۲-۶-۱ توانایی مهار رادیکال­های آزاد DPPH عصاره­ها
توانایی مهار رادیکال­های آزاد در حضور ۵ عصاره­های متانولی مورد مطالعه، توسّط آزمایش DPPH بررسی شد. معادله خط رگرسیونی که رابطه غلظت­های مختلف محلول آنتی­اکسیدان سنتزی (اسیدآسکوربیک) را با میزان جذب نمونه­­ها در طول موج ۵۱۷ نانومتر نشان می­دهد، به صورت ذیل می­باشد.
Y=15.057X-10.18 R2=0.989
نتایج درصد مهار رادیکال­های آزاد در جدول­های (شکل ۳-۱۷)، (شکل ۳-۱۸)، (شکل ۳-۱۹)، (شکل ۳-۲۰)، (شکل ۳-۲۱) و (شکل ۳-۲۲) مشخص شده است.
هم چنین، برای مقایسه بهتر فعّالیّت عصاره­ها از نظر توانایی مهار رادیکال­های آزاد DPPH، مقادیر IC50 در جدول (۳-۸) تعیین گردید.
۳-۲-۶-۱-۱ نتایج مهار رادیکال­های آزاد عصاره بادام کوهی
توانایی مهار رادیکال­های آزاد در حضور عصاره متانولی بادام کوهی و آنتی­اکسیدان سنتزی اسیدآسکوربیک توسط آزمون DPPH بررسی شد. با افزایش غلظت عصاره، مهار رادیکال­ها با قدرت بیشتری صورت گرفت که نتایج آن در نمودار (شکل ۳-۱۷) مشخص شده است. توانایی مهار رادیکال­های آزاد عصاره بادام کوهی در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر، ۵۱/۸۶% می­باشد که در مقایسه با اسیدآسکوربیک ۰۹/۹۴% کمی ضعیف­تر است. نتایج آنالیز واریانس نشان داد، غلظت عصاره بادام کوهی و آنتی­اکسیدان سنتزی تأثیر معنی­داری (P<0.05) بر میزان مهار رادیکال­های آزاد دارد.
شکل (۳-۱۷) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره متانولی بادام کوهی (Amygdalus scoparia) و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
۳-۲-۶-۱-۲ نتایج مهار رادیکال­های آزاد عصاره بومادران
گونه گیاهی بومادران از نظر میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH در غلظت­های گوناگون ارزیابی و مشخص شد که با افزایش غلظت عصاره متانولی بومادران از ۵۰۰-۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر درصد مهار رادیکال­های آزاد به طور چشمگیری افزایش می­یابد. همان­گونه که در نمودار (شکل ۳-۱۸) مشاهده می­ شود اختلاف معنی­داری در فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره بومادران با اسیدآسکوربیک وجود دارد. در غلظت­های پایین اختلاف بین عصاره و اسیدآسکوربیک کم و با افزایش غلظت اختلاف بین آن­ها افزایش می­یابد. نتایج آنالیز واریانس نشان داد، اختلاف معنی­داری بین عصاره متانولی بومادران و اسیدآسکوربیک در سطح احتمال ۵% وجود دارد.
شکل (۳-۱۸) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره متانولی بومادران (Achillea millefolium) و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
۳-۲-۶-۱-۳ نتایج مهار رادیکال­های آزاد عصاره کلپوره
نتایج آنالیز واریانس نشان داد، در غلظت­های پایین توانایی درصد مهار رادیکال­های آزاد DPPH در عصاره متانولی کلپوره بیشتر از آنتی­اکسیدان سنتزی بود اما در غلظت­های بالاتر از ۵/۶۲ میلی­گرم بر میلی­لیتر، اسیدآسکوربیک فعالیت آنتی­اکسیدانی بیشتری نسبت به عصاره نشان داد. هم­چنین اختلاف معنی­داری بین درصد مهار رادیکال­های آزاد در عصاره و اسیدآسکوربیک در غلظت ۲۵/۳۱ میلی­گرم بر میلی­لیتر وجود ندارد. غلظت عصاره متانولی کلپوره و آنتی­اکسیدان سنتزی تاثیر معنی­داری (P<0.05) بر میزان مهار رادیکال­های آزاد دارد (شکل ۳-۱۹).

شکل (۳-۱۹) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره متانولی کلپوره (Teucrium polium) و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
۳-۲-۶-۱-۴ نتایج مهار رادیکال­های آزاد عصاره گلپر
در نمودار (شکل ۳-۲۰) درصد مهار رادیکال­های آزاد DPPH عصاره متانولی کلپوره و آنتی­اکسیدان سنتزی در مقابل غلظت نشان می­دهد که اسیدآسکوربیک در اغلب غلظت­های مورد بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی بیشتری نسبت به عصاره گلپر دارد. در غلظت­های ۸/۷ و ۶۲/۱۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر درصد مهار عصاره بیشتر از اسیدآسکوربیک بود و در غلظت ۲۵/۳۱ میلی­گرم بر میلی­لیتر تفاوت معنی­داری مشاهده نشد. به طور کلی اختلاف معنی­دار در درصد مهار رادیکال­های آزاد عصاره و اسیدآسکوربیک با افزایش غلظت مشهود است.
شکل (۳-۲۰) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره متانولی گلپر (Heracleum persicum) و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
۳-۲-۶-۱-۵ نتایج مهار رادیکال­های آزاد عصاره مریم گلی
عصاره متانولی مریم گلی درجه­ای از درصد مهار رادیکال­های آزاد DPPH را به صورت وابسته به غلظت نشان داد، در حالی که آنتی­اکسیدان سنتزی دارای توانایی آنتی­اکسیدانی بالاتری می­باشد. اسیدآسکوربیک در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر بالاترین درصد مهار برابر با ۰۹/۹۴% و عصاره گیاهی حاضر با درصد مهار ۲۵/۵۳%، دارای فعالیت کمتری می­باشد. در غلظت ۲۵/۳۱ میلی­گرم بر میلی­لیتر تفاوت معنی­داری مشاهده نشد و در غلظت­های ۸/۷ و ۶۲/۱۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر درصد مهار عصاره مریم گلی بیشتر از اسیدآسکوربیک بود. همان گونه که در نمودار شکل (۳-۲۱) مشخص است، افزایش غلظت عصاره و آنتی­اکسیدان سنتزی تأثیر معنی­داری بر میزان مهار رادیکال­های آزاد دارد.
شکل (۳-۲۱) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره متانولی مریم گلی (Salvia officinalis) و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
۳-۲-۶-۱-۶ نتایج مقایسه­ ای درصد مهار عصاره­ها و اسیدآسکوربیک
نتایج آنالیز واریانس نشان داد، غلظت عصاره­ها و آنتی­اکسیدان سنتزی تاثیر معنی­داری (P<0.05) بر میزان مهار رادیکال­های آزاد داشتند. هم­چنین، توانایی عصاره­ها در مهار رادیکال­های آزاد همزمان با افزایش غلظت افزایش یافت. نمودار (شکل ۳-۲۲)، میزان مهار رادیکال­های آزاد توسط غلظت­های مختلف عصاره­های متانولی گیاهان مورد بررسی و آنتی­اکسیدان سنتزی را نشان می­دهد. در محدوده غلظت ۵۰۰-۵/۶۲ میلی­گرم بر میلی­لیتر، بیشترین قدرت مهارکنندگی پس از اسیدآسکوربیک به ترتیب مربوط به عصاره­های بادام کوهی و گلپر می­باشد. در محدوده غلظت ۲۵/۳۱-۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر، عصاره­ الکلی کلپوره فعّالیّت آنتی­اکسیدانی بیشتری نسبت به اسیدآسکوربیک نشان داد. در تمامی غلظت­ها، اغلب کم­ترین توانایی مهارکنندگی مربوط به عصاره بومادران است.
شکل (۳-۲۲) : مقایسه میانگین میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط غلظت­های مختلف عصاره­های متانولی مورد بررسی و آنتی­اکسیدان سنتزی. حروف غیر مشابه در هر غلظت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در سطح احتمال ۵% می­باشند.
مقادیر IC50 هر یک از عصاره­های متانولی مورد مطالعه، به منظور مقایسه دقیق­تر آن­ها از نظر توانایی مهار رادیکال­های آزاد DPPH تعیین گردید (شکل ۳-۲۳). در این روش، IC50 عبارت است از غلظتی از عصاره که قادر به مهارکردن ۵۰% از رادیکال­های آزاد DPPH در محیط واکنش می­باشد. بنابراین هر چه این غلظت کمتر باشد نشان­دهنده این است که فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره بیشتر است. همان طور که در نمودار مشاهده می­ شود کمترین مقدار IC50 متعلق به آنتی­اکسیدان سنتزی اسیدآسکوربیک و پس از آن مربوط به عصاره­های متانولی بادام کوهی و گلپر می­باشد. بیشترین مقدار IC50 متعلق به عصاره مریم گلی است.
شکل ۳-۲۳: مقایسه میانگین مقادیر IC50 (میلی­گرم عصاره بر میلی­لیتر) عصاره­های متانولی گیاهان مورد مطالعه در آزمون ارزیابی میزان مهار رادیکال­های DPPH. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۶-۲ قدرت احیاکنندگی عصاره­ها
۳-۲-۶-۲-۱ نتایج تعیین قدرت احیاکنندگی عصاره بادام کوهی
نتایج آنالیز واریانس نشان داد، قدرت احیاکنندگی در آنتی­اکسیدان سنتزی در هر غلظت مورد مطالعه بیشتر از عصاره متانولی بادام کوهی می­باشد. در غلظت­های مورد بررسی، اختلاف زیادی در میانگین قدرت احیاکنندگی عصاره حاضر و اسیدآسکوربیک وجود ندارد، این اختلاف در غلظت­های پائین این بیشتر اما با افزایش غلظت کاهش می­یابد. همان گونه که در نمودار (شکل ۳-۲۴) مشخص است تفاوت معنی­داری در میانگین جذب عصاره بادام کوهی و اسیدآسکوربیک در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر وجود ندارد. غلظت عصاره بادام کوهی و آنتی­اکسیدان سنتزی تاثیر معنی­داری (P<0.05) بر قدرت احیاکنندگی دارد.
شکل ۳-۲۴: مقایسه میانگین قدرت احیاکنندگی غلظت­های مختلف عصاره متانولی بادام کوهی (Amygdalus scoparia) و آنتی­اکسیدان سنتزی اسیدآسکوربیک. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۲-۶-۲-۲ نتایج تعیین قدرت احیاکنندگی عصاره بومادران
عصاره متانولی بومادران درجه­ای از درصد جذب را در طول موج ۷۰۰ نانومتر به صورت وابسته به غلظت نشان داد. نمودار (شکل ۳-۲۵) نشان از توانایی قدرت احیاکنندگی بالاتر آنتی­اکسیدان سنتزی دارد. اسیدآسکوربیک در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر دارای درصد جذب ۶۸۰/۱% و عصاره گیاهی حاضر با درصد جذب ۵۵۷/۱%، دارای فعالیت احیاکنندگی کمتری می­باشد. آنالیز مقایسه­ ای درصد جذب در نمودار ذیل نشان می­دهد که افزایش غلظت عصاره و آنتی­اکسیدان سنتزی تأثیر معنی­داری بر میزان قدرت احیاکنندگی دارد.
شکل ۳-۲۵: مقایسه میانگین قدرت احیاکنندگی غلظت­های مختلف عصاره متانولی بومادران (Achillea millefolium) و آنتی­اکسیدان سنتزی اسیدآسکوربیک. حروف غیر همسان نشان دهنده وجود تغییرات معنی­دار در سطح ۵% بر اساس آزمون دانکن می­باشد. داده ­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.

 

Add a Comment

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *